鲨鱼肝油是中性烷基甘油、角鲨烯等生物活性物质的氧化重要来源，具有良好的铝柱生理保健功能。烷基甘油是层析纯化醇制成分一种醚脂质化合物，根据甘油骨架上连接的分离烷烃链饱和度与长度的不同，主要分为鲨肝醇(十八烷氧基甘油)、鲨肝鲨油醇(十八-烯烷氧基甘油)、品及鲛肝醇(十六烷氧基甘油)等。其组其中，中性鲨肝醇是氧化烷基甘油重要的组成部分。具有对抗因细胞毒类药物或苯中毒引起的铝柱造血系统抑制，抗癌、层析纯化醇制成分防癌，分离促进白细胞增生及抗放射线等作用，鲨肝是品及重要的免疫刺激因子。目前鲨肝醇富集工艺较为不成熟且不同原料中的鲨肝醇含量参差不齐，在售的鲨肝醇产品为富含鲨肝醇的鲨鱼肝油，大多为化学合成，而化学合成的鲨肝醇存在生物活性功效低下等问题。
目前，国内外鲨肝醇分离、纯化的方法主要有超临界流体法、分子蒸馏法、酯交换法、柱色谱法、薄层色谱法(TLC)等。Vazquez等同采用超临界流体萃取技术分离、纯化鲨鱼肝油中的鲨肝醇，得到高纯度的鲨肝醇。然而，超临界流体萃取法设备投入高，操作相对复杂。郭正霞利用氧化铝柱层析技术分离、纯化鲨肝醇，使鲨鱼肝油不皂化物中鲨肝醇含量明显提高。其未考察洗脱液、洗脱流速等因素对柱层析效果的影响。本研究以鲨鱼肝油中不皂化物为原料。采用中性氧化铝柱层析分离、纯化鲨肝醇的工艺，通过气相色谱法(GC)与薄层层析法(TLC)分析制备样品中角鲨烯等活性物质，以期为鲨肝醇富集工艺及鲨鱼肝油的高值化利用提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
粗制鲨鱼肝油，海力生集团有限公司：鲨肝醇标品(纯度≥98％)、硅烷化试剂(VBSIFA：VTMCS=99:1)、100～200目中性氧化铝，国药集团化学试剂有限公司；角鲨烯标品(纯度≥99％)，美国Sigma公司；氢氧化钾、乙醇(95％)、盐酸、二氯甲烷、正己烷、无水甲醇、乙醚、乙酸等均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
7890B气相色谱仪，美国Agilent公司；电子天平AL204型，梅特勒-托利多有限公司；层析柱(φ3.0cm×60cm)、硅胶板(φ5.0cm×10.0cm)，国药集团化学试剂有限公司；旋转蒸发仪RE-3000，上海亚荣生化仪器厂：SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸易有限工艺；BT50S蠕动泵，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司：Fresco-21G台式离心机，美国ThermoFisher公司：Milli-pore超纯水系统，美国Millipore公司。
1.3 试验方法
1.3.1 不皂化物的提取参
考GB/T5535.2-2008《动植物油脂不皂化物测定第2部分：己烷提取法》和叶虔臻等的方法提取鲨鱼肝油中不皂化物。称取50g鲨鱼肝油于500mL三颈烧瓶中，加入150mL1mol/L氢氧化钾-乙醇溶液，在70℃条件下反应50min。待反应结束后，从冷凝管顶部加入150mL蒸馏水，冷却至室温，再将反应液倒入500mL分液漏斗中，用200mL正己烷萃取3次。合并萃取液，然后用10％乙醇水溶液清洗萃取液至中性。若在清洗过程中出现乳浊现象，则加少量无水乙醇破乳。萃取液经无水硫酸钠脱水、旋蒸得不皂化物，充氮后低温保存备用。
1.3.2 层析柱的制作
参考龚金炎等的方法制作中性氧化铝层析柱。称取250g粒径100～200目的中性氧化铝与500mL蒸馏水混合，加入浓盐酸，调节溶液pH值至2，保持10min后用蒸馏水洗涤至中性。置105℃条件下活化24h。采用干法装柱。待氧化铝界面不再下降。用二氯甲烷洗脱除柱子中的杂质，平衡2h，静置待用。
1.3.3 TLC检测
参考郭正霞的方法对样品进行TLC检测，并作适当修改。具体操作如下：取硅胶板置于103℃条件下干燥活化1h。放入干燥器中冷却至室温待用。称取样品100mg溶解于1mL二氯甲烷中，毛细管点样于TLC硅胶板上，以V正己烷:V乙醚:V乙酸=85:15:1为展开液，碘蒸气显色。
1.3.4 GC测定鲨肝醇
将TLC硅胶板上对应的鲨肝醇条带刮下，加入500μL硅烷化试剂(VBSTFA:VTMCS=99:1)，于65℃水浴30min，冷却后氮气吹扫，脱除多余溶剂后加入2mL正己烷复溶，过滤待测。加入硅烷化试剂的目的是进行衍生化处理。
气相色谱条件：HP-5毛细管色谱柱(30m×0.32mm，0.25μm)；升温程序：初温200℃保持5min后，以5℃/min升至280℃，保持20min；进样口温度250℃，不分流进样，进样量1μL，载气流速1mL/min。因鲨肝醇标准品需衍生化处理后方可GC检测。故无法绘制标准曲线。本试验采用峰面积归一化法分析鲨肝醇的纯度。每组样品重复测试3次。
1.3.5 GC测定角鲨烯气
相色谱条件：HP-5毛细管色谱柱(30m×0.32mm，0.25μm)；升温程序：初温160℃，以15℃/min升至220℃，保持2min；然后以5℃/min升至280℃，保持20min；最后以5℃/min升至300℃，保持2min。进样口温度250℃，分流比1:10，进样量1μL，载气流速1mL/min。每组样品重复测试3次。
准确称取25mg角鲨烯标准品于25mL容量瓶中，加入少量正己烷定容至刻度，配制1mg/mL角鲨烯标准储备液。分别取一定量的标准储备液用正己烷稀释。配成质量浓度分别为20，50，100，200，400μg/mL及800μg/mL的标准工作液。以各质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制角鲨烯标准曲线。
1.3.6 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，依据DesignExpert8.0软件中的Box-Behnken设计中心组合试验，选取洗脱液比例、上样量和洗脱流速3个因素，每40mL为1个收集单位，以鲨肝醇纯度为响应值，做三因素三水平的中心组合试验，以确定氧化铝柱层析分离富集鲨肝醇最佳工艺参数。响应面因素水平及编码值见表1。
相关链接：氧化铝柱，角鲨烯，二氯甲烷，乙醚
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